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LAMP: nuovi protocolli per la diagnosi in campo di P. ramorum e X. fastidiosa

Phytophthora ramorum e Xylella fastidiosa sono due patogeni invasivi da quarantena che negli ultimi anni, in Italia come in altri paesi europei, stanno assumendo molta importanza a causa della minaccia che la loro diffusione può rappresentare sia nell’ambiente vivaistico sia in ecosistemi naturali. La presenza di questi agenti, infatti, può rappresentare una seria minaccia per l’ambiente vivaistico causando notevoli perdite in termini di produzione che molto spesso si traducono in perdite economiche per il vivaista. La pericolosità di questi patogeni tuttavia, non è limitata al solo vivaio, ma anche all’ambiente naturale dove il microrganismo potrebbe sfuggire causando seri danni alle piante e compromettendo allo stesso tempo la biodiversità dell’ecosistema. Sono stati intrapresi vari studi a livello nazionale e internazionale riguardanti le specie invasive, focalizzati spesso sulla ricerca di metodologie per mitigare i danni prima che si verifichino fasi di espansione delle malattie e recentemente si sono sviluppate tecniche molecolari sempre più accurate, quali PCR e real-time PCR, per rilevare la presenza di patogeni nei tessuti delle piante prima che i sintomi siano evidenti.
 
L’applicazione di queste tecniche, tuttavia, richiede condizioni controllate di laboratorio, cicli di analisi elaborati e materiale di analisi (DNA) purificato che costituiscono un limite alla crescente necessità di verificare in campo la presenza di un patogeno, esigenza che si sta rivelando di grande importanza per il controllo delle patologie vegetali, soprattutto nei punti di ingresso come porti e aeroporti. A questo scopo, la tecnica molecolare di recente ottimizzazione denominata LAMP (Loop mediated isothermal amplification) è risultata essere quella maggiormente adatta in quanto fornisce vantaggi in termini di semplicità ed efficienza rispetto alla classica PCR. Recentemente, inoltre, è stato diffuso sul mercato lo strumento Genie II (Optigene, UK) che, essendo portatile e robusto, permette di compiere un’analisi LAMP direttamente in campo. Nell'ambito del progetto PATINVIVA, finanziato dalla Fondazione Cassa di Risparmio di Pistoia e Pescia, l'Istituto per la Protezione Sostenibile delle Piante del CNR, in collaborazione con il Vivaio Giorgio Tesi Group, ha potuto acquistare lo strumento ed è stato possibile ottimizzare due protocolli di diagnosi precoce per P. ramorum e X. fastidiosa.

Dall’analisi di tessuti vegetali infetti da questi patogeni, è stato possibile verificare che i protocolli sviluppati riescono a diagnosticare la presenza di P. ramorum e X. fastidiosa  e a diversificarli da altri organismi a loro tassonomicamente vicini. Attraverso analisi con minime quantità di DNA dei due patogeni, è stato inoltre possibile verificare che il metodo funziona anche quando sono presenti, nei tessuti da analizzare, basse concentrazioni di DNA di P. ramorum e X. fastidiosa. Per validare ulteriormente il metodo, sono stati confrontati i risultati ottenuti dall’analisi LAMP effettuata con Genie II con un’analisi sugli stessi campioni con real-time PCR già messa a punto per questi patogeni: la capacità di diagnosi delle due tecniche è risultata la stessa. I protocolli sviluppati con tecnica LAMP hanno mostrato, oltre alla rapidità di analisi (30 minuti), facilità di interpretazione dei risultati e richiesta minima di equipaggiamento che li rendono l’ideale per l’applicazione in campo.

Nonostante la tecnica LAMP sia stata applicata ad oggi soprattutto nell’ambito di malattie animali e solo recentemente in patologia vegetale per Hymenoscyphus fraxineus, Guignardia citricarpa e Erwinia amylovora, la sua applicazione nel settore vivaistico e in ecosistemi naturali potrebbe portare numerosi vantaggi. L’applicazione di questo metodo di diagnosi come controllo per la presenza di patogeni da quarantena come P. ramorum e X. fastidiosa, anche possibile su campioni asintomatici, potrebbe favorire le verifiche del materiale importato ed esportato in vivaio e le verifiche dello stato fitosanitario di individui in bosco, permettendo la realizzazione di un monitoraggio assai sensibile e specifico, volto a limitare la diffusione incontrollata di questi agenti patogeni, come di altri che in un futuro, anche prossimo, potrebbero creare rischi per l'industria vivaistica o per gli ecosistemi naturali. 

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La tecnica permette un’analisi istantanea delle piante da controllare con risultati immediati. Lo studio del CNR-IPSP di Firenze

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